وقتی آزمایشی با شکست مواجه می شود، آیا تا به حال انگشت خود را به سمت معرف های گران قیمت یا ابزار پیچیده نشانه رفته اید؟ اما گاهی اوقات ممکن است "مقصر" واقعی بی سر و صدا در گوشه - آن بطری به ظاهر معمولی معرف بافر پنهان شده باشد. اگرچه نامشخص است، اما راه نجاتی برای حفظ دقت آزمایش است. امروز راز این "نگهبان نامرئی" را برملا می کنیم.
Ⅰ. بافر: چیه؟ چرا در آزمایشگاه ضروری است؟
به زبان ساده، بافر یک سیستم محلول ویژه است که می تواند در برابر اثرات مقدار کمی اسید، قلیایی یا رقت افزوده مقاومت کند و مقدار pH نسبتاً پایدار محلول را حفظ کند. معمولاً از یک جفت "شریک" - یک اسید ضعیف و باز مزدوج آن (یا یک باز ضعیف و اسید مزدوج آن)، مانند اسید استیک/استات سدیم (HAc/Ac-)، سدیم دی هیدروژن فسفات/دی سدیم هیدروژن فسفات (NaH2NPO, و غیره) تشکیل شده است. در آزمایشگاه ها
توانایی هسته: تثبیت pH و مقاومت در برابر تغییرات!
هنگامی که مقدار کمی از مواد اسیدی یا قلیایی به طور تصادفی وارد آزمایش می شود، "شریک" در بافر به سرعت واکنش نشان می دهد، مانند یک "دروازه یون هیدروژن" کارآمد، آن را جذب یا آزاد می کند، در نتیجه از نوسانات شدید در مقدار pH محلول جلوگیری می کند. این توانایی برای بسیاری از واکنش های بیوشیمیایی که به یک محیط pH خاص متکی هستند ضروری است.
Ⅱ. مرحله آزمایشگاهی: یک قهرمان اصلی و نقش مکمل
1. "سیستم پشتیبانی از زندگی" آزمایش های بیوشیمیایی:
تحقیق فعالیت آنزیم:بیشتر آنزیم ها فقط در محدوده PH باریک فعالیت بهینه دارند. بافرها (مانند Tris-HCl، PBS) یک "میز کار" پایدار برای واکنش های آنزیمی برای اطمینان از نتایج قابل اعتماد فراهم می کنند.
تصفیه و تجزیه و تحلیل پروتئین:از لیز سلولی، جداسازی کروماتوگرافی (تبادل یونی، کروماتوگرافی میل ترکیبی) تا الکتروفورز (مانند SDS{0}}PAGE)، تبلور پروتئین و ذخیره سازی، هر مرحله به یک بافر با pH خاص نیاز دارد تا ساختار، بار و حلالیت پروتئین را حفظ کند و از دناتوره شدن یا رسوب جلوگیری کند.
دستکاری اسید نوکلئیک:واکنش PCR، استخراج DNA/RNA، هضم آنزیمی، بستن، هیبریداسیون و سایر فرآیندها به PH بسیار حساس هستند. بافرهای رایج مانند TE (Tris{1}}EDTA) می توانند ساختار اسیدهای نوکلئیک را تثبیت کرده و از تجزیه نوکلئازها محافظت کنند.
2. "لالایی" کشت سلول:محیط کشت سلولی (مانند DMEM، RPMI) خود یک سیستم بافر پیچیده است (اغلب به سیستم بی کربنات سدیم/دی اکسید کربن متکی است). افزودن بافرهای اضافی (مانند HEPES) میتواند محیط pH پایدارتری را برای سلولها فراهم کند، به خصوص هنگام تغییر مایعات، مشاهده یا زمانی که غلظت دی اکسید کربن ممکن است در نوسان باشد، تا از رشد سلولی سالم اطمینان حاصل شود.
3. "نیروی تثبیت کننده" شیمی تجزیه:
جداسازی کروماتوگرافی:در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و کروماتوگرافی یونی (IC)، pH فاز متحرک پارامتر کنترلی کلیدی برای اثر جداسازی است و بافرها (مانند فسفات ها و استات ها) تکرارپذیری فرآیند جداسازی را تضمین می کنند.
تجزیه و تحلیل تیتراسیون:برخی از واکنشهای تیتراسیون باید در pH ثابت انجام شوند یا نقطه پایانی را نشان دهند که به pH خاصی میرسد و بافر نقش تثبیتکننده را ایفا میکند.
تهیه محلول های استاندارد:مقدار pH بسیاری از محلول های استاندارد باید دقیقاً کنترل شود و بافرها اساس آن هستند.
Ⅲ. انتخاب و استفاده: دانش زیاد
سیستم بافر مناسب را انتخاب کنید:
مقدار pKa کلیدی است:محدوده بافر موثر یک بافر معمولاً در محدوده مقدار pKa 1 ± آن است. مطمئن شوید که بافری با مقدار pKa نزدیک به pH کاری مورد نیاز خود انتخاب کنید! به عنوان مثال، فسفات (pKa ~ 7.2) اغلب در محدوده pH خنثی استفاده می شود و Tris (pKa ~ 8.1) اغلب در قلیایی استفاده می شود.
سازگاری:در نظر بگیرید که آیا اجزای بافر با واکنش تجربی شما تداخل دارند یا خیر (مثلاً فسفات ممکن است با برخی از مطالعات فسفوریلاسیون تداخل داشته باشد و بورات ممکن است با قندها واکنش نشان دهد).
قدرت و دما یونی:قدرت یونی بر فعالیت آنزیم، حلالیت و غیره تأثیر می گذارد. تغییرات دما می تواند به طور قابل توجهی بر مقدار pKa بافرهایی مانند Tris تأثیر بگذارد (Tris دارای ضریب دمای pKa زیادی در حدود -0.031 / درجه است).
Ⅳ. فهرست بافرهای رایج
1. سری بافر PBS
بافر PBS 1× (pH7.4)، بافر PBS 10× (pH7.4)، پودر فسفات PBS (بدون یونهای کلسیم و منیزیم): شستشوی سلولها در آزمایشهای کشت سلولی (مانند قبل از تغییر محیط کشت). رقیق کردن آنتی بادی ها و شستشوی صفحات الایزا در آزمایش های ایمونولوژی. حفظ فشار اسمزی و ثبات pH در آزمایشات پروتئین / اسید نوکلئیک و غیره
بافر DPBS (بدون کلسیم و منیزیم)، پودر فسفات DPBS (بدون یون کلسیم و منیزیم): فلوسیتومتری در آزمایشات سلولی، شستشو پس از هضم سلول (برای جلوگیری از تداخل کلسیم و منیزیم با فعالیت آنزیم). رقیق کردن آنزیمها یا انجام آزمایشهای حساس به یون-در زیستشناسی مولکولی (مانند واکنشهای خاص PCR) و غیره.
بافر PBST (1×)، بافر PBST (10×): برای مسدود کردن و شستشوی مراحل در وسترن بلات یا ایمونوهیستوشیمی، کاهش اتصال غیر اختصاصی و غیره استفاده می شود.
2. سری بافر TBS
بافر TBS (1×)، بافر TBS (10×): جایگزین بافر PBS در آزمایشات ایمونولوژی (برای جلوگیری از تداخل فسفات با اتصال آنتی بادی خاص). تثبیت محیط pH قلیایی در آزمایشات پروتئین و غیره
3. سری بافر HBSS
بافر HBSS (بدون کلسیم و منیزیم، فاقد فنل قرمز)/بافر هنک (بدون کلسیم و منیزیم): جداسازی سلول و شستشوی گریز از مرکز در آزمایشات سلولی (مانند فلوسیتومتری). نگهداری کوتاه مدت-سلول (مانند تصویربرداری از سلول زنده)، و غیره. بافر HBSS (بدون کلسیم و منیزیم، فاقد فنل قرمز): حفظ فعالیت متابولیک سلولی در کشت سلولی (کلسیم و منیزیم در انتقال سیگنال شرکت میکنند). آزمایشات مهاجرت/تهاجم سلولی
4. سری بافر TE
بافر TE (1×)، بافر TE (10×): DNA/RNA را حل کرده و ذخیره می کند (Tris pH را حفظ می کند، EDTA یون های فلزی را کلات می کند تا فعالیت نوکلئاز را مهار کند). DNA رقیق برای PCR، توالی یابی و آزمایش های دیگر.
5. سری بافر الکتروفورز
بافر TAE (1×): الکتروفورز ژل DNA آگارز معمولی (رزولوشن پایین، مناسب برای قطعات بزرگ DNA). بافر TBE (1×)، بافر TBE (10×): الکتروفورز DNA/RNA با وضوح بالا (مانند قطعات کوچک یا الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید). الکتروفورز طولانی مدت (ظرفیت بافر بهتر از TAE است).
6. سری بافر آزمایش وسترن بلات
بافر انتقال وسترن بلات (10×): بافری که برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشا (مانند غشای PVDF)، حاوی تریس، گلیسین و متانول استفاده می شود.
تریس{0}}بافر هیدروکلراید (1mol/L، pH6.8): تهیه ژل غلیظ SDS{3}}PAGE و غیره.
تریس{0}}بافر هیدروکلراید (1.5mol/L، pH8.8): تهیه ژل جداسازی SDS{3}}PAGE و غیره.
7. سری بافر pH استاندارد
بافر pH=4.00/6.86/9.18 (تهیه شده 250 میلی لیتر): محلول استاندارد برای کالیبراسیون pH متر (به عنوان مثال pH6.86 استاندارد خنثی است، pH4.00 و 9.18 استانداردهای اسیدی و قلیایی هستند).
معرفهای بافر به هیچ وجه نقش حمایتی اساسی در آزمایشگاه ندارند. ارزش اصلی آنها در ارائه یک محیط پروتونی دقیق و پایدار نهفته است، که سنگ بنای حفظ تعادل ترمودینامیکی و سرعت جنبشی اکثر واکنشهای بیوشیمیایی است. از تنظیم ریزمحیط سایتهای فعال آنزیم، تا تضمین پایداری ساختاری بیومکرومولکولها، تا حفظ گرادیانهای یونی گذرنده، ظرفیت بافر pH سیستم بافر یک پیشنیاز ضروری برای تکرارپذیری و قابلیت اطمینان دادههای تجربی است. Beekman شما را در سفر تحقیقاتی علمی شما همراهی خواهد کرد.
هونان BKMAM Holding Co., Ltd
وب سایت: www.bkmbio.com
ایمیل:info@bkmbio.com